大阪大学大学院工学研究科のクラユヒナエレナ特任助教、野田勝紀特任研究員、内山進准教授らの研究グループは、蛍光超遠心分析法により血清中におけるTNFと抗TNF抗体の相互作用様式を世界で初めて解明しました。血清中には様々なタンパク質や代謝物が混在しているため、in vivo環境に近い状態での抗原-抗体の相互作用の定量的な解析は不可能でした。しかし、近年開発された蛍光超遠心法により、生体内に近い状態での抗原-抗体複合体の検出が可能となりました。今回の研究により、抗TNF抗体は、抗体の種類、や抗原と抗体の濃度比により、異なったサイズの抗原-抗体複合体を形成することが明らかとなりました （図1） 。さらに、抗体に結合するFc受容体を細胞に発現する組換え細胞を用いたアッセイにより、抗原-抗体複合体の大きさが大きくなると細胞内での信号伝達が強くなることが分かりました。今後、本手法が抗体医薬品のin vivoでの有効性や副作用の予測に利用されることが期待されます。

本研究成果は、英国科学誌「mAbs」に、2017年4月8日（土）に掲載されました。

図1　蛍光超遠心分析法により、抗TNF抗体は、血清中で異なったサイズの抗原-抗体複合体を形成することが明らかとなった。

これまで、バイオ医薬品 の一種である抗体医薬品の有効性や副作用発現を分子レベルで理解するため、抗原と抗体間の結合メカニズムに注目した研究が盛んに行われてきました。抗体医薬品が実際に投与されるのは血液中ですので、血液中での抗体医薬の振る舞いを知ることが重要です。ところが、血液は多くのタンパク質が存在する複雑な環境であるため、血液中での抗体や抗原の振る舞いを正確に調べることは難しく、実際のin vivo環境での抗原-抗体結合様式には多くの不明点がありました。

今回、内山准教授らの研究グループは、3種類の抗TNF抗体と抗原であるTNFを用いて、リン酸緩衝液とヒト血清中におけるTNF-抗TNF抗体の相互作用様式を、抗原と抗体の濃度をin vivoと同様の濃度に設定した上で、蛍光超遠心分析法により解析しました （図2(A)） 。その結果、血清中での複合体の結合様式とサイズ分布は、リン酸緩衝液と異なっており、抗TNF抗体の種類と抗体と抗原の濃度比によってサイズ分布が異なることが明らかとなりました （図2(B)） 。一方、抗体の受容体であるFcγRを発現させた Jurkat 細胞を用いたレポーターアッセイにより、超遠心分析で観測された複合体サイズとFcγRを介したシグナル伝達の強さには、高い相関があることが確認されました。これらの結果により、抗原-抗体複合体のサイズと生体内での免疫反応との関連が示唆されました。

図2　蛍光超遠心分析法により、血清中における測定データ（A）とその解析により得た沈降係数分布（B）。

体内と類似の濃度と環境での抗原抗体複合体のサイズ分布の評価は、抗体医薬品のin vivoでの有効性や副作用発現をin vitroの結果から予測するために有効であり、今後、本手法を用いることで、より安全で薬効が高い抗体医薬品が創出されることが期待されます。

本研究成果は、2017年4月8日（土）に米国科学誌「mAbs」（オンライン）に掲載されました。

タイトル：“Analytical ultracentrifugation with fluorescence detection system reveals differences in complex formation between recombinant human TNF and different biological TNF antagonists in various environments”
著者名：Elena Krayukhina, Masanori Noda, Kentaro Ishii, Takahiro Maruno, Hirotsugu Wakabayashi, Minoru Tada, Takuo Suzuki, Akiko Ishii-Watabe, Masahiko Kato, and Susumu Uchiyama

なお、本研究は、国立医薬品食品衛生研究所およびシスメックス社との共同研究のもと、以下の助成を受けて行われました。

・日本学術振興会科学研究費補助金（挑戦的萌芽研究 15K14457、新学術領域研究 16H00770、26102530）
・岡崎統合バイオサイエンスセンター共同研究プロジェクト（Bio-NEXT）
・日本医療研究開発機構（医薬品等規制調和・評価研究事業）